在微生物實(shí)驗(yàn)室, 必須達(dá)到一定程度的無菌狀態(tài), 免于微生物污染. 假如在一個(gè)骯臟的實(shí)驗(yàn)室或者早先打翻過樣品的地方做微生物實(shí)驗(yàn), 引入新的微生物污染樣品的幾率是很大的。微生物的實(shí)驗(yàn)可以分為兩大部分: 準(zhǔn)備培養(yǎng)基和樣品檢驗(yàn)。事實(shí)上, 保持整個(gè)實(shí)驗(yàn)室清潔是非常重要的, 這樣就不用在滅菌前擔(dān)心太多了, 然而, 滅菌后必須保證樣品或者培養(yǎng)基免受污染。其實(shí), 可以把滅菌想像成"一扇門", 在培養(yǎng)基中或者一些設(shè)備比如吸管的微生物都在滅菌過程中被殺死了, 沒有微生物困擾實(shí)驗(yàn)了。必須保證滅菌后的環(huán)境(門后的部分)的潔凈, 杜絕滅菌后的培養(yǎng)基和設(shè)備受到污染。無菌的重要性無菌技術(shù) – 高壓濕熱滅菌要點(diǎn) 描述 原理 在壓力下產(chǎn)生的濕熱的蒸汽殺死微生物的營養(yǎng)體和孢子. 密封 滅菌鍋必須密閉以阻隔外部空氣, 避免空氣的存在會影響壓力并降低滅菌鍋里面的溫度 滅菌壓力 在滅菌國內(nèi), 合適的滅菌溫度是通過壓力達(dá)到的, 壓力對于滅菌沒有效用但是使蒸汽溫度上升. 對于標(biāo)準(zhǔn)操作來說, 15lbs/inch2時(shí)的1210C并趕走所有空氣可以達(dá)到滅菌的效果 滅菌時(shí)間 當(dāng)?shù)竭_(dá)一定的溫度和壓力時(shí), 需要保持一定的時(shí)間來達(dá)到效果, 為了殺滅微生物, 1210C必須保持至少15分鐘。 培養(yǎng)基的滅菌 大部分情況下, 實(shí)驗(yàn)室配置培養(yǎng)基后應(yīng)滅菌, 滅菌時(shí)應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商指導(dǎo), 使用合適的溫度時(shí)間; 有些培養(yǎng)基不適合滅菌的. 器皿的滅菌 當(dāng)滅菌那些器皿時(shí), 需要考慮使用數(shù)量, 比如, 一天用10根吸管, 在滅菌時(shí), 一般就可以以10根為一包, 這樣可以減低器皿在使用過程中遭受微生物的污染的可能性. 滅菌條 在滅菌過程中, 可以用滅菌條來監(jiān)控效果, 滅菌條在滅菌前是有顏色的, 滅菌后會變成黑色. 重新滅菌 假如一次滅菌無效, 可以重新進(jìn)行滅菌過程, 但是, 培養(yǎng)基是不可以進(jìn)行第二次滅菌的, 應(yīng)拋棄. 儲存 滅菌完成后, 培養(yǎng)基和器皿應(yīng)妥善儲存. 一般來說, 培養(yǎng)基應(yīng)存放于避光的潔凈空間, 同時(shí)應(yīng)參照供應(yīng)商的指示. 無菌技術(shù) – 過濾 (Filtration)要點(diǎn) 描述 簡述 物理分離方法, 使用過濾將微生物從液體培養(yǎng)基分離使用于對熱敏感的培養(yǎng)基和化學(xué)品, 比如, 當(dāng)需要酒石酸來調(diào)節(jié)OSA的酸度時(shí)由于不需要加熱和冷卻過程, 過濾比高溫濕熱滅菌省時(shí)間, 過濾頭 0.2微米的過濾頭可以分離所有的細(xì)菌營養(yǎng)體, 把它安裝在針筒末端. 無菌過程注意點(diǎn)要點(diǎn) 描述 綜述 一旦培養(yǎng)基或者器皿經(jīng)過滅菌過程, 這種滅菌狀態(tài)應(yīng)保持直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束. 區(qū)域 能把培養(yǎng)基準(zhǔn)備區(qū)域(門外)和實(shí)驗(yàn)區(qū)域(門內(nèi))分開. 工作臺面 工作前必須消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒劑. 消毒時(shí)間 不管使用何種消毒劑, 需要提供充分的消毒時(shí)間來殺滅微生物, 一般5-10分鐘. 可以用紙巾擦干表面 潔凈臺 必須有2個(gè)光源: 普通照明用和殺菌紫外光. 紫外燈用于保持工作臺面免于微生物污染. 在使用前仍然需要使用消毒劑清潔. 擺放 應(yīng)該有好習(xí)慣把工作桌面的物品擺放好, 把移動(dòng)放到zui低限度, 避免帶來污染 鑷子 如果使用薄膜過濾法, 需要準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯并有少量酒精, 鑷子不用時(shí)就放在杯子里 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基使用前, 應(yīng)該有相關(guān)日期, 比如配置日期, 或者實(shí)驗(yàn)室收到日期(直接使用的培養(yǎng)基). 假如沒有所需日期, 這個(gè)培養(yǎng)基不能使用. 實(shí)驗(yàn)服 穿著干凈的實(shí)驗(yàn)服, 袖子應(yīng)卷起至肘部以避免碰到培養(yǎng)基或樣品帶來污染, 當(dāng)然, 做實(shí)驗(yàn)前要洗手. 實(shí)驗(yàn)的無菌技術(shù)注意點(diǎn)采樣 個(gè)人衛(wèi)生 酒精燈 樣品應(yīng)無菌采得使用無菌采樣袋或者采樣瓶采樣員應(yīng)戴防護(hù)手套, 在采樣前燒采樣口樣品容器應(yīng)緊閉并安全儲存. 萬一培養(yǎng)基或者樣品濺到實(shí)驗(yàn)服上, 應(yīng)在做完一個(gè)實(shí)驗(yàn)后換上干凈的咳嗽或者鼻塞可能會帶來微生物并影響實(shí)驗(yàn), 應(yīng)戴好防護(hù)手套面罩. 使用本森燈或者酒精燈, 在實(shí)驗(yàn)前點(diǎn)燃火焰在實(shí)驗(yàn)區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)防護(hù)層, 可以防止那些懸浮在空氣中的微生物掉落在工作臺面上或者培養(yǎng)基上. 開瓶 瓶口 培養(yǎng)皿 開瓶前, 應(yīng)用清潔劑的紙巾清潔瓶蓋和附近區(qū)域, 除去蓋子上可能留存的微生物 蓋子打開后, 玻璃瓶口應(yīng)進(jìn)行滅菌, 可以在酒精燈上方旋轉(zhuǎn)瓶口和螺紋, 一般2-3秒. 當(dāng)打開培養(yǎng)皿時(shí), 不能*移除蓋子, 而應(yīng)該保持在培養(yǎng)皿的上側(cè), 從而能夠倒入培養(yǎng)基或者樣品, 這樣可以減少空氣灰塵或者微生物的污染;倒完培養(yǎng)基或者樣品后, 瓶口重新過火, 蓋蓋子, 用消毒劑清潔. 濾膜 鑷子 打開薄膜包裝, 不能碰到薄膜! 用鑷子把薄膜移除包裝并放到過濾頭上, 過濾的漏斗不能*移開, 只需移開一點(diǎn)點(diǎn)放入濾膜即可過濾完后, 用鑷子把濾膜轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中, 放置于中間 用鑷子轉(zhuǎn)移濾膜過火時(shí), 拿住鑷子的尾部, 放到火焰上, 保持一下能夠到火就好, 時(shí)間太長會在尖部結(jié)碳 拿鑷子的時(shí)候, 尾部向上直至燒完. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束 打掃 廢棄物 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱; 剩余的培養(yǎng)基可以放回儲存區(qū)域, 蓋子必須蓋緊 拋棄廢棄物, 比如樣品袋; 可回用的物品放在遠(yuǎn)離工作區(qū)域的地方以回收, 清洗, 滅菌.用含有消毒劑的紙巾清潔工作臺面. 在實(shí)驗(yàn)過程中暴露于微生物的物品應(yīng)作為有害廢棄物這些廢棄物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能會產(chǎn)生公共衛(wèi)生的事件.廢棄物能夠進(jìn)行濕熱滅菌 從微生物的實(shí)驗(yàn)室布局角度一個(gè)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)室能提供一個(gè)合格的環(huán)境以支持實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虬踩行У剡M(jìn)行. 首先, 需要為實(shí)驗(yàn)室選擇一個(gè)合適的物理位置:遠(yuǎn)離其他操作區(qū)域, 比如, 生產(chǎn)或者儲運(yùn)；沒有從其他區(qū)域進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的直接入口；實(shí)驗(yàn)室必須是微生物實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為準(zhǔn)備區(qū)域和測試區(qū)域. 濕熱滅菌鍋, 作為這兩個(gè)區(qū)域的典型的分隔(門). 這種分隔保證了能有效使用無菌技術(shù)并幫助防止培養(yǎng)基和樣品的交叉污染；假如兩個(gè)區(qū)域無法分開, 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和測試兩個(gè)行為來區(qū)分不同的區(qū)域。通風(fēng)和氣流 安保 工作區(qū)域 微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有單獨(dú)的通風(fēng)系統(tǒng), 與其他操作區(qū)域的空氣供給分開;房間應(yīng)該是負(fù)壓的, 這表示實(shí)驗(yàn)室里面的空氣永遠(yuǎn)是向內(nèi)流動(dòng)的;空調(diào)系統(tǒng)的排氣必須直接排出實(shí)驗(yàn)室, 空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)定時(shí)清洗, 并關(guān)注空氣過濾器的清潔 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該是限制進(jìn)入的, 可以是卡片控制或者其他方式, 只有那些被允許進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的人員才能進(jìn)入 實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)該有充足的工作區(qū)域, 從GLP標(biāo)準(zhǔn)來說, 每人應(yīng)有20平方米的區(qū)域. 充足的工作區(qū)域可以避免工作中人員的碰撞, 也避免了交叉污染. 易清潔 門和窗 照明 實(shí)驗(yàn)室的墻面, 屋頂和門都應(yīng)該是平滑的, 光潔易于清洗消毒的;墻的接縫包括強(qiáng)和墻之間, 強(qiáng)和地面之間應(yīng)該是弧形的任何地方都應(yīng)該不能聚集灰塵, 例如窗臺或者窗簾柜子應(yīng)該是可移動(dòng)的或者是不著地的以方便清掃. 窗戶應(yīng)密封, 門應(yīng)緊閉以避免外面空氣進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室如果窗戶壞了或者有裂縫額, 應(yīng)及時(shí)報(bào)修, 并盡快修好 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充足的照明, 包括不間斷電源或者備用發(fā)電機(jī) 遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則 1.GLP要點(diǎn) – 工作區(qū)域要點(diǎn) 描述 總體安排 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)做好儀器, 試劑和培養(yǎng)基的所有準(zhǔn)備工作, 這樣可以合理利用時(shí)間并得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 桌面安放 多余的培養(yǎng)皿, 燒瓶或者濾紙可能會干擾實(shí)驗(yàn)并帶來潛在的濺出, 打碎或者交叉污染. 實(shí)驗(yàn)前消毒 在配制培養(yǎng)基或者開始試驗(yàn)前, 應(yīng)該清潔并消毒工作桌面. *的消毒劑是70%的酒精溶液, 含氯水的溶液, 或者公司批準(zhǔn)的其他消毒劑. 使用一次性的消毒紙巾, 不能使用毛巾或者海綿. 清潔后, 應(yīng)等待幾分鐘以使有充分的時(shí)間殺滅微生物, 可以用紙巾擦干. 試驗(yàn)后消毒 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, *清潔工作區(qū)域, 仍然使用70%酒精溶液或者公司批準(zhǔn)的其他消毒劑, 保持一段時(shí)間, 然后擦干 有害廢棄物的處置 必須有效管理微生物的有毒廢棄物, 任何和微生物培養(yǎng)或者培養(yǎng)基相關(guān)的物品都應(yīng)被看作有害物質(zhì); 因?yàn)樗麄兛赡芎兄虏【? 需要小心處理 廢棄物的滅菌 濕熱滅菌是zui簡單也是zui有效的處理污染物質(zhì)和有害物質(zhì)的方法. 用過的培養(yǎng)皿應(yīng)放在滅菌袋中. 滅菌后, 可以當(dāng)作一般廢棄物處理 重復(fù)使用器皿的滅菌 當(dāng)需要對小件物品(比如移液管)滅菌時(shí), 可以根據(jù)實(shí)際用量分組包裝. 濕熱滅菌后, 袋包裝冷卻并保存. 避免浪費(fèi) 合理安排是非常重要的; 實(shí)驗(yàn)室工作需要, 但是有時(shí)候我們也需要快速工作, 因?yàn)榛ǚ浅６鄷r(shí)間會延長設(shè)備, 培養(yǎng)基, 或者樣品暴露在環(huán)境中的時(shí)間. 把需要用的物品放在手邊可以用的地方可以節(jié)約時(shí)間并提高工作的有效性. 2.GLP要點(diǎn) – 潔凈工作臺簡介 使用 監(jiān)控 潔凈工作臺提供了控制來自環(huán)境的污染并提供工作區(qū)域的潔凈空氣. 潔凈空氣吹向工作區(qū)域, 同時(shí), 可以避免外部空氣進(jìn)入工作區(qū)域 使用時(shí), 紫外光線(或者紫外燈)應(yīng)關(guān)閉, 但是使用后應(yīng)打開. 如果紫外燈沒有打開工作臺沒有開啟, 工作臺不能開始使用; 必須清潔工作臺, 開啟電源并打開紫外燈, 保持30分鐘. 潔凈工作臺需要進(jìn)行日常的確認(rèn), 一般有第三方公司進(jìn)行. 一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該是一個(gè)安全的實(shí)驗(yàn)室. 假如疏忽安全的話, 許多每天使用的培養(yǎng)基或者設(shè)備會產(chǎn)生危害. 減少這些危害帶來的風(fēng)險(xiǎn)不僅僅保護(hù)了工作場所, 更重要的是, 保護(hù)了自身免于危險(xiǎn)。利用常識并遵照GLP相關(guān)的安全規(guī)則, 我們就能把由于微生物相關(guān)的行為帶來的潛在危害降低到zui小。安全用品 移動(dòng) 安全用品包含口罩, 手套和眼部防護(hù). 口罩防止培養(yǎng)基和樣品受到污染, 可能來自于咳嗽或者鼻涕; 根據(jù)當(dāng)?shù)氐囊蠛土?xí)慣, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室會有不同的要求戴手套是為了防止培養(yǎng)基或者其他刺激性物質(zhì)接觸皮膚; 在從濕熱滅菌鍋內(nèi)取出容器或則器皿時(shí), 需要戴防熱手套在配置培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)中佩戴防護(hù)眼鏡是一個(gè)很好的習(xí)慣, 能夠購買帶有屈光度的防護(hù)眼鏡為佳. 當(dāng)移動(dòng)培養(yǎng)基或者樣品時(shí), 應(yīng)小心注意以避免濺出或者潑出; 突然的移動(dòng)會產(chǎn)生安全危害或者導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無效不要使用夸張的動(dòng)作或者行為同時(shí), 不要把任何東西, 比如吸管, 放到嘴里 明火 濕熱滅菌鍋 實(shí)驗(yàn)中需要用到酒精燈或其他明火, 但是假如使用不當(dāng)會帶來比較高的安全危險(xiǎn)確保酒精燈不用時(shí)*關(guān)閉, 當(dāng)有閥門時(shí)經(jīng)常檢查墊圈是否有裂痕或者泄露.操作酒精燈時(shí), 應(yīng)確?；鹧娌粫佑|衣物或者皮膚. 可燃物品, 比如記錄本, 應(yīng)遠(yuǎn)離火焰以避免意外點(diǎn)燃. 同時(shí), 要注意可燃液體的容器. 每次使用后應(yīng)蓋好蓋子并遠(yuǎn)離酒精燈火焰使用火焰進(jìn)行滅菌工作時(shí), 可使用鑷子. 把鑷子放在含有95%酒精的燒杯中, 使用時(shí), 把鑷子在火焰上灼燒1-2秒, 移開鑷子并等待火焰熄滅. 拿著鑷子是應(yīng)向下, 使熱的酒精不會流到手上. 濕熱滅菌鍋使用高壓下產(chǎn)生的蒸汽, 溫度可達(dá)1210C, 殺死了微生物, 同樣可以帶來人類組織的灼傷, 所以必須特別小心地操作; 如此高的溫度以及蒸汽能帶來極大的潛在傷害, 即使是殘留的蒸汽也能帶來很大的危險(xiǎn). 打開滅菌鍋時(shí)需要特別小心, 站在邊上避免面對熱量和蒸汽, 緩慢的打開門, 同時(shí), 戴好防熱手套. 把需要滅菌的培養(yǎng)基和器皿平均放置在托盤上, 大的物品放在邊上, 確保物品不會相互碰撞. 這樣可以是熱量均勻擴(kuò)散并平衡整個(gè)托盤 潔凈臺 樣品操作 在潔凈臺工作時(shí)必須關(guān)閉紫外燈. 紫外光線是危險(xiǎn)的,不要把手或者手指放在紫外燈下, 以免灼傷皮膚; 不要直接看紫外光線以免損傷眼睛 培養(yǎng)基和樣品: 用火焰灼燒瓶口時(shí), 停留4-5秒, 旋轉(zhuǎn)使整個(gè)表面都能被灼燒, 不要停留太久, 不要濺出樣品或者培養(yǎng)基假如樣品是瓶裝的, 不要直接灼燒以免爆開. 可以取2個(gè)燒杯, 倒入70%酒精, 把瓶子倒置放入一個(gè)燒杯中, 使蓋子和瓶頸的2.5厘米處能浸沒在酒精中, 拿出瓶子用干凈的布擦干; 同理, 放入第二個(gè)燒杯, 拿出瓶子直立待酒精自然蒸發(fā). 開瓶時(shí)應(yīng)特別小心不能污染樣品, 可以用消毒紙巾開旋蓋的瓶子; 用浸沒在95%酒精并灼燒的開瓶器打開壓蓋瓶. 打開瓶子后, 使用相同的方法灼燒瓶口, 并確保用于消毒的酒精*揮發(fā).拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭頂部, 假如罐子必須用開罐器, 這個(gè)開罐器操作同開瓶器. 無菌包裝的產(chǎn)品用含70%酒精的棉球擦拭 細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)箱必須分開放置嗎？在CNAS-CL09:2013《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明 》有此規(guī)定：5.3.3 e)檢測樣品中的霉菌時(shí)，要有適當(dāng)?shù)拇胧┛刂奇咦釉诳諝庵械臄U(kuò)散。但未見到明確規(guī)定細(xì)菌培養(yǎng)箱和霉菌培養(yǎng)箱不能在同一房間的規(guī)定。一般實(shí)驗(yàn)室都有三種培養(yǎng)箱，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上分為兩種，一種是內(nèi)部循環(huán)風(fēng)溫度平衡的，第二種是內(nèi)外熱空氣流動(dòng)自動(dòng)平衡型的，另外第三種是熱輻射溫度平衡型的。有網(wǎng)友認(rèn)為，*種和第三種應(yīng)該可以放在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，保持一定距離即可。第二種培養(yǎng)箱應(yīng)該不能放在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室。據(jù)說，CNAS現(xiàn)場評審，會提出細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)箱分開放置要求。 防止培養(yǎng)基長霉的方法當(dāng)環(huán)境溫度不適應(yīng)果蠅生長時(shí)(溫度低于18℃) ,培養(yǎng)基接種后的7d內(nèi),特別容易長霉。要避免長霉,應(yīng)注意:①培養(yǎng)果蠅的器皿要嚴(yán)格消毒。培養(yǎng)瓶洗干凈后,自然涼干, 再與棉塞一道進(jìn)行高溫干燥滅菌(120℃, 30min) 。②培養(yǎng)基營養(yǎng)要全面。果蠅培養(yǎng)基的種類很多,本實(shí)驗(yàn)室用的是玉米培養(yǎng)基,配方如下:水750mL煮開,加瓊脂6. 2g,待瓊脂溶解后加白糖62.5g,攪拌溶解后加調(diào)成糊狀的玉米糊(玉米粉82. 5g,用冷水調(diào)成糊狀) ,煮開2～3min,加酵母粉7g,加熱1～2min,攪拌均勻后,移去火源,加丙酸2mL (起殺菌防霉的作用) 。培養(yǎng)基稍稍冷卻后,倒入已滅菌的培養(yǎng)基瓶中,盡量不要讓培養(yǎng)基粘在瓶壁上,塞好棉塞,放入仍有余熱的干燥箱中將瓶壁上的水蒸干。③接種時(shí)消好毒。在無菌室內(nèi)接種, 如沒有無菌室, 在接種前用75%酒精棉球擦雙手一遍。接種后,放入適宜果蠅生長溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)果蠅(溫度20～25℃) ,一旦下一代成蠅孵出來后,培養(yǎng)基就不易長霉。 一般微生物實(shí)驗(yàn)室只有一個(gè)培養(yǎng)室，而用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)箱一般是內(nèi)循環(huán)的。所以是可以同一個(gè)房間的。